Die Rolle von LRP1 in der Funktion des NMDA-Rezeptors

Ein funktionelles Zusammenspiel von LRP1, einem Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie, mit dem NMDA-Rezeptor, einem Glutamat Rezeptor, wurde durch die Interaktion beider Proteine sowie eine tPa-vermittelte, LRP1-abhängige Signalübertragung durch den NMDA-Rezeptor belegt. Darüber hinaus zeigen Mäuse mit einem konditionellen neuronalen knock-out des Lrp1 Gens Verhaltensänderungen, die mit einer beeinträchtigten Signalübertragung durch NMDA-Rezeptoren assoziiert werden könnten. Die genaue Rolle von LRP1 in der NMDA-Rezeptor-Funktion bleibt allerdings noch unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von LRP1 bei der Expression der NR2B-Untereinheit des NMDA-Rezeptors an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone untersucht. Zu diesem Zweck wurde die knock-in Mauslinie LRP1ΔNPxY2, die sich durch eine Alanin Substitution im NPxY2 Motiv des LRP1 auszeichnet, eingesetzt. rnEs konnte gezeigt werden, dass diese knock-in Mutation in einer erhöhten Expression von LRP1 und der NMDA-Rezeptoruntereinheiten NR1 und NR2B an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone resultiert. Der Effekt konnte durch eine reduzierte Endozytoserate von LRP1 und der NR1-und NR2B-Untereinheiten in primären LRP1ΔNPxY2 Neuronen erklärt werden. Darüber hinaus wurde ein verändertes Phosphorylierungsmuster der Internalisierungssignale der NR2B-Rezeptoruntereinheit Serin S1480 und Tyrosin Y1472 an der Zelloberfläche primärer LRP1ΔNPxY2 Neurone detektiert. Die verantwortlichen Kinasen Fyn und Kasein-Kinase II sind allerdings in LRP1ΔNPxY2 Neuronen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen nicht abweichend reguliert. In den Co-Immunopräzipitationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Bindung von LRP1 mit NR2B durch die Phosphorylierung reguliert wird und dieser Regulationsmechanismus in LRP1ΔNPxY2 Neuronen beeinträchtigt ist. Dies resultiert in einer stärkeren Bindung von NR2B-Rezeptoruntereinheit an LRP1. Aufgrund reduzierter Internalisierungsraten von LRP1 in LRP1ΔNPxY2 Neuronen führt dieser Umstand zu einer Akkumulation beider Rezeptorproteine an der Zelloberfläche. Schließlich wurden die NMDA-Rezeptor-assoziierten Verhaltensänderungen wie die Hyperaktivität und die Defizite im direkten und umgekehrten räumlichen Lernvermögen in den LRP1ΔNPxY2 Tieren nachgewiesen. Zusammengefasst, demonstrieren diese Ergebnisse, dass LRP1 eine kritische Rolle in der Regulierung der NR2B-Expression an der Zelloberfläche spielt.

Proteolysis of the receptor for advanced glycation end products by matrix metalloproteinases

RAGE mediates diverse physiological and pathological effects by binding a variety of ligands. Despite incomplete understanding of RAGE-mediated disorders soluble RAGE (sRAGE) has been identified as a potential biomarker for RAGE-related diseases and possibly represents a hopeful pharmaceutical against RAGE-mediated disorders. Nevertheless, the source of sRAGE remains poorly investigated. Currently sRAGE is thought to be derived exclusively from alternative splicing of mRNA. In this thesis it was investigated whether sRAGE can also be released as a result of ectodomain shedding of full-length RAGE. Using cells overexpressing RAGE as a model system, it was demonstrated clearly that RAGE undergoes ectodomain shedding in both constitutive and regulated manner. Several stimuli including PMA, AMPA, calcium and chelerythrine stimulated the release of sRAGE into cell culture medium. Moreover, possible mechanisms that regulate ectodomain shedding of RAGE were investigated and it was found that shedding of RAGE is likely independent from PKC and MAPK pathways. By using gain of function and loss of function approaches MMP9 but not ADAM10, ADAM17 or MT1-MMP was characterized as the metalloproteinase that mediates shedding of RAGE. Furthermore, it was shown that cytoplasmic domain of RAGE is not essential for shedding of RAGE. In addition, the potential cleavage site of RAGE by MMP9 was investigated and a lack of sequence specificity for the RAGE processing proteinase was demonstrated by mutation analysis. Finally the physiopathological significance of shedding of RAGE is discussed. In conclusion, for the first time ectodomain shedding of human RAGE and the underlying regulatory mechanisms were investigated. The data open a new field for modulation of RAGE shedding as a novel intervention approach against RAGE-mediated diseases.